Мобильная версия

Журнал "Гастроэнтерология" Том 56, №2, 2022

Особливості слизового бар’єра при функціональних захворюваннях кишечника та неспецифічному виразковому коліті

Авторы: Дорофєєв А.Е. (1), Ткач С.М. (2), Дядик О.О. (1), Приходько В.М. (1)
(1) — Національний університет охорони здоров’я України імені П.Л. Шупика, м. Київ, Україна
(2) — Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, м. Київ, Україна

Рубрики: Гастроэнтерология

Разделы: Клинические исследования

Актуальність. Слизовий бар’єр кишечника може змінюватися через вплив екзогенних та ендогенних факторів. Зміни його фізичних та хімічних характеристик спостерігаються як при шлунково-кишкових захворюваннях, таких як синдром подразненого кишечника, неспецифічний виразковий коліт, хвороба Крона, так і при інших патологіях — цукровому діабеті, харчовій алергії, ревматоїдному артриті тощо. Також на проникність стінки кишечника впливають тісні контакти, які послаблюються через порушення дієти, психоемоційні чинники та хімічні агенти. Метою роботи була оцінка змін слизового бар’єра у пацієнтів з функціональними та запальними захворюваннями кишечника. Матеріали та методи. Було досліджено 270 пацієнтів з різними підтипами синдрому подразненого кишечника та 218 з неспецифічним виразковим колітом. Усім пацієнтам була проведена колоноскопія з подальшою морфологічною оцінкою біоптатів та проведенням імуногістохімічних досліджень з використанням маркерів клаудину-1 та -7, муцинів 1, 2, 3, 4, 5АС, трефоїлових факторів 1–3. Результати. У пацієнтів з функціональним ураженням кишечника спостерігалось зниження кількості клаудинів — білків щільних контактів. Клаудин-1 знижувався у пацієнтів із синдромом подразненого кишечника, асоційованим з діареєю, у той час як клаудин-7 — у пацієнтів із синдромом подразненого кишечника зі змішаною формою. При неспецифічному виразковому коліті спостерігалось зниження рівня експресії як секреторних, так і мембранозв’язуючих муцинів і при цьому збільшення виділення трефоїлових факторів, що вказує на порушення регуляції та зниження протективних властивостей слизу. Висновки. При функціональних та запальних захворюваннях кишечника порушення захисної функції слизової оболонки має різний патогенез, що може визначати різні підходи до лікування пацієнтів з такими патологіями.

Background. The intestinal mucosal barrier may change under the influence of exogenous and endogenous factors. Changes in its physical and chemical characteristics are observed in patients with gastrointestinal diseases, such as irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn’s disease, and with other pathologies, such as diabetes mellitus, food allergies, rheumatoid arthritis, etc. Also, the permeability of the intestinal wall was influenced by tight junctions, which are weakened due to eating disorders, psycho-emotional factors, and chemical agents. The purpose of the study was evaluating of changes in the mucosal barrier in patients with functional and inflammatory bowel diseases. Materials and methods. 270 patients with different subtypes of irritable bowel syndrome and 218 patients with ulcerative colitis were examined. Colonoscopy followed by a morphological assessment of biopsy specimens and immunohistochemical studies using markers of claudin 1 and 7, mucins 1, 2, 3, 4, 5AC, and trefoil factors 1–3 was performed in all patients. Results. A decrease in the level of tight junction proteins called claudins was observed in patients with functional bowel disease. Patients with irritable bowel syndrome associated with diarrhea had a lower level of claudin-1 only, while patients with mixed form had also a lower level of claudin-7. A decrease in the level of both secretory and membrane-bound mucins and an increase in the level of the trefoil factors were observed at the same time among the patients with ulcerative colitis which may indicate a dysregulation and a violation of the protective function of mucus. Conclusions. The pathogenesis of a violation of the protective function of the mucosa of functional and inflammatory bowel disease is different, which may determine approaches to the treatment of patients with such pathologies.

Ключевые слова

слизовий бар’єр кишечника; функціональні захворювання кишечника; синдром подразненого кишечника; неспецифічний виразковий коліт

mucosal barrier of the bowel; functional bowel disease; irritable bowel syndrome; nonspecific ulcerative colitis

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2308-2097.56.2.2022.493

Вступ

Захисна функція слизового бар’єра кишечника (СБК) визначається балансом клітинного і гуморального імунітету, оптимальним співвідношенням облігатної та факультативної флори, кількістю та властивостями слизу товстого кишечника, станом та структурою його епітелію та міжклітинних контактів. Слизовий бар’єр кишечника відіграє важливу роль у розвитку не лише патології шлунково-кишкового тракту, але й інших органів і систем. Експериментальні та клінічні дослідження продемонстрували, що СБК може моделюватися цілою низкою факторів: дієта, стрес, бактеріальні агенти, лікувальні засоби. Відмічається зв’язок підвищеної проникності слизової оболонки кишечника з хворобами різних органів і систем: функціональні і запальні захворювання кишечника (ЗЗК), целіакія, харчові алергії, цукровий діабет, ревматоїдний артрит, шизофренія, розсіяний склероз, уролітіаз тощо. Це свідчить про значимість СБК для підтримка здоров’я людини [1–3].

Модифікація проникності СБК з формуванням вісцеральної гіперчутливості і мікрозапалення слизової оболонки кишечника є одним з основних патогенетичних механізмів розвитку функціональної патології, зокрема синдрому подразненого кишечника (СПК). При СПК через порушення сприйняття інтенсивності імпульсу і зміни порогу больової чутливості розвиваються патологічні реакції через вісь мозок — кишечник — мозок, що призводить до психосоматичних розладів і зміни поведінкових реакцій [4].

Найбільш значні зміни СБК виявлені у пацієнтів з постінфекційним СПК, що підтверджує важливу роль порушення мікробіому в розвитку підвищеної проникності СБК. Виявлений корелятивний зв’язок між підвищеною проникністю СБК і симптомами тривоги і депресії у цих пацієнтів [4, 5].

Продукція, якісний та кількісний склад слизу кишечника у пацієнтів із СПК змінюється менш значно, ніж у хворих із запальними захворюваннями кишечника, у той же час при СПК важлива роль у зміні проникності слизового бар’єра кишечника відводиться порушенням щільних контактів. Структурна стабільність щільних контактів може бути скомпрометована як ендогенними (прозапальні цитокіни, серинові протеази тучних клітин), так і екзогенними факторами (стрес, серинові протеази та хемотактичні пептиди бактерій, гліадин, алкоголь, дієта з високим умістом жирів) [6–8].

Метою нашої роботи була оцінка зміни слизового бар’єра у пацієнтів з функціональними та запальними захворюваннями кишечника.

Матеріали та методи

Під нашим наглядом знаходилось 270 пацієнтів з різними підтипами СПК і 218 пацієнтів, у яких був діагностований неспецифічний виразковий коліт (НВК). Усім пацієнтам проводилась колоноскопія з біопсією. При морфологічній оцінці, окрім загальноприйнятих методів забарвлення (гематоксилін-еозин, PAS-реакція), проводили імуногістохімічне дослідження біоптатів кишечника з використанням маркера клаудину-1 та -7, муцинів 1, 2, 3, 4, 5АС, трефоїлових факторів (TFF1–3).

Імуногістохімічне (ІГХ) дослідження клаудинів, муцинів та трефоїловох факторів виконували на парафінових зрізах. Біоптати були фіксовані в 10% формаліні (pH 7,2–7,4) з подальшим вкладенням у гасові блоки. Секції гасової тканини (4 μm) були депарафінізовані та повторно гідратовані. Пошук антигена, який використовується для виявлення моноклональних антитіл, проводили в 10 мм кислоти (рН 6,0) при 95 °С протягом 20 хв. Після цього секції промивали в 0,15 М NaCl і 0,1 М буфера Tris/HCl (рН 7,4), що містить 0,05% Твін-20. Неспецифічне зв’язування блокували блоком білка (Дако) протягом 30 хв. Секції інкубували з антитілом BC2, розбавляючи в розчиннику антитіл протягом 1 години, і потім інкубували з кон’югатом з широким спектром Poly HRP («USBiological», США) протягом 30 хв при 37 °С, а після цього з 3,3-діамінобензидином протягом 30 хвилин. Секції контрастували з гематоксиліном протягом 30 секунд, для отримання синього кольору ефект 37 ммоль клону. Оцінка антигена порівнювалася з негативним контролем.

Демаскування антигенів проводили в цитратному буфері (рН = 6,0) при кип’ятінні на водяній бані протягом 1 години. Як первинні антитіла використовували мишачі моноклональні антитіла («USBiological», США), а також систему візуалізації KP-500 («Diagnostic Biosystems», США). При перегляді препаратів на світлооптичному рівні антигенпозитивні клітини ідентифікували за їх коричневим забарвленням. Інтенсивність ІГХ-забарвлення з клаудинами, муцинами та TFF оцінювалася напівкількісно за методикою G.M. Sheehan, 2007 [9] (табл. 1).

Результати та обговорення

У пацієнтів з СПК, при порівнянні зі здоровими, характерними змінами було зниження експресії білків щільних контактів (клаудинів) в біоптатах слизової оболонки різних відділів товстої кишки (рис. 2). При цьому порівняльний аналіз профілю експресії білків щільних контактів між підтипами захворювання виявив вірогідне зниження експресії клаудину-1 у пацієнтів з СПК, асоційованим з діареєю (СПК-Д), яке не спостерігалось при інших підтипах СПК ((2,0 ± 0,17) бала при нормі (2,81 ± 0,11) бала) [10, 11]. У той же час, за нашими даними, відмічається зменшення експресії клаудину-7 не тільки у пацієнтів з СПК-Д, але й у пацієнтів зі змішаною формою СПК (СПК-М) (рис. 1, 2) ((1,91 ± 0,17) бала та (2,23 ± 0,21) бала відповідно, при нормі (2,89 ± 0,10) бала).

Важливо відмітити, що вищезазначені порушення корелюють не тільки з вираженістю симптоматики, але і з фактом активації тучних клітин у власній пластинці слизової оболонки кишечника, які є ефекторною ланкою імунної відповіді. Активація тучних клітин призводить до їх дегрануляції з вивільненням різних біологічно активних речовин, які включають серинові протеази (триптаза, хімаза), гістамін і серотонін. Дані фактори шляхом зв’язку зі специфічними рецепторами нервових терміналей ноцицептивних аферентних нейронів призводять до сенсибілізації з формуванням феномену вісцеральної гіперчутливості [12, 13].

У хворих із запальними захворюваннями кишечника — НВК та хворобою Крона розвивається ціла низка позакишкових проявів — уражень органів і систем, пов’язаних з підвищеним антигенним навантаженням і зміненою системною імунною відповіддю, порушенням проникності слизового бар’єра кишечника. При ЗЗК важливу роль у стабільності СБК відіграють рівень експресії і ступінь глікозилювання муцинів, які характеризують спроможність протективної функції слизового бар’єра кишечника. Епітеліальні муцини — це велика група секреторних, а також трансмембранних глікопротеїнів, що багаті на серин, треонін і пролін, пов’язаних великим числом олігосахаридних ланцюгів. Виділяють 2 класи муцинів: секреторні (MUC2, MUC5AC, MUC5В, MUC6) і трансмембранні (MUC1, MUC4, MUC13, MUC16, MUC17), до того ж при ЗЗК, особливо при НВК, більшою мірою страждає продукція секреторних муцинів [14]. Муцини активно експресуються епітелієм кишечника, у якому формують високомолекулярний в’язко-еластичний шар, який є протективним бар’єром між поверхнею слизової оболонки і порожнинним умістом шлунково-кишкового тракту, що є поживним середовищем для життєдіяльності коменсальних бактерій. В умовах розвитку запального процесу при ЗЗК муцини зазнають характерних змін: сульфатування знижується, а сіалування збільшується, що відображає зниження резистентності муцину до бактеріального руйнування і сприяє підвищенню проникності СБК [14, 15].

Згідно із сучасними уявленнями, у тонкому кишечнику, сліпій кишці і проксимальних та дистальних відділах товстого кишечника переважно експресуються MUC2, MUC4, MUC3 і MUC17, при цьому в незміненій слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту їх локалізація співпадає з розподіленням трефоїлових пептидів. Трефоїлові фактори (TFF1–3) разом з муцинами відіграють важливу роль у формуванні гастроінтестинального бар’єра і СБК. Вони виконують протективну і регенераторну функції. TFF синтезуються і секретуються муцинпродукуючими клітинами і тісно пов’язані з муцинами. Проте молекулярні механізми взаємодії муцинів і трефоїлових пептидів, а також різноманіття їх властивостей ще недостатньо добре вивчені. Вважається, що на відміну від TFF1 і TFF2 тільки TFF3 експресується колоноцитами. Усі три трефоїлові фактори забезпечують процеси міграції клітин, беруть участь у полімеризації муцинів, що сприяє підвищенню захисної функції епітелію [15]. Зміни СБК при ЗЗК характеризуються змінами експресії муцинів і трефоїлових пептидів та призводять до зниження його захисних властивостей, що стимулює клітини імунної системи і сприяє підтриманню запалення в товстому кишечнику при НВК [14, 15].

За нашими даними, рівень експресії секреторного (MUC2) і мембранопов’язаних (MUC3, MUC4) муцинів у всіх пацієнтів з НВК був низьким (табл. 2). При цьому найбільш вираженим було зниження MUC2 і MUC3, яке проявлялось негомогенністю забарвлення вакуоль келихоподібних клітин аж до його повної відсутності, що свідчить про значне зниження секреторної активності клітин слизової оболонки товстого кишечника (СОТК), зниження її протективної функції при НВК.

При НВК з мінімальною активністю за шкалою Мейо відмічалось інтенсивне забарвлення муцинів у цитоплазмі навколо вакуоль і помірне — у базальних відділах клітин епітелію (за методикою G.M. Sheehan, 2007) [9] порівняно з хворими із II та III ступенем активності. Це може відображати високу інтенсивність метаболічних процесів в епітеліальних клітинах кишечника у пацієнтів з мінімальною активністю НВК за шкалою Мейо. У той же час низька експресія MUC2 і MUC3 у поверхневому епітелії, яка виявлена у більшості досліджених пацієнтів з I–III ступенем активності НВК, може характеризувати неефективність репаративних процесів слизової оболонки при загостренні захворювання (рис. 3).

Загальна експресія MUC2 и MUC3 була помірною в келихоподібних клітинах і у вакуолях у пацієнтів з хворобою Крона.

Більше ніж у половини хворих з НВК відмічалось забарвлення клітин строми від слабкої до високої експресії як MUC2, так і MUC3 (за методикою G.M. Sheehan, 2007) [9], що свідчить про активність мітозу і процесів диференціювання епітеліальних клітин строми в келихоподібні ентероцити. Ці зміни можуть бути індукованими високою інтенсивністю запального процесу в товстому кишечнику і мати компенсаторний характер. Експресія секреторних муцинів пов’язана з прозапальними цитокінами: TNF-α, INF-γ, IL-6 [13]. Тому її відсутність у вакуолях келихоподібних клітин і поява у стромі свідчить також про локалізацію запального процесу у власній пластинці СОТК, що є характерним для НВК. У той же час хронічне запалення, яке викликане бактеріальними інфекціями (ентеропатогенна та гемолізуюча E.coli, Salmonella enteritidis, Clostridium difficile тощо), асоціюється з підвищеною експресією секреторних муцинів у поверхневих відділах, обмежуючи проникнення мікроорганізмів углиб слизової оболонки кишечника [8].

Надмірна активація трансмембранних муцинів призводить до стимуляції ядерного фактора транскрипції (NF-κB) та канонічного інгібітора ядерного фактора — κВ кінази-β (IKKβ), які асоціюються з неоплазією, індукованою хронічним запаленням, що може пояснити високу частоту малігнізації при тривалому перебігу НВК [16].

Експресія TFF3 у слизовій оболонці товстого кишечника у хворих з НВК була високою на відміну від секреторних муцинів (за методикою G.M. Sheehan, 2007) [9], що свідчить про порушення регуляторного впливу трефоїлових пептидів на експресію та протективні властивості муцинів.

При НВК локалізація TFF3 характеризувалась нерівномірністю: більшою мірою експресія спостерігалась в базальних відділах клітин крипт, помірна — у вакуолях келихоподібних клітин (рис. 4). У деяких випадках спостерігалась виражена поверхнева локалізація TFF3 у поєднанні з відсутністю чи низькою експресією MUC2 і MUC3, що, ймовірно, відображає виснаження секреторної функції келихоподібних клітин при збереженні стимулюючого впливу TFF3 на муциноутворення у відповідь на запалення.

Отже, для хворих з НВК характерно зниження захисних функцій слизового бар’єра за рахунок зменшення як розрідженого (MUC2 і MUC3), так і щільного шару муцинів, сформованого більшою мірою мембрановбудованими муцинами (MUC3 і MUC4). Спостерігається порушення взаємодії муцинів та трефоїлового фактора, що знижує протективні властивості муцинів та регенераторний потенціал СОТК у хворих з НВК. Це призводить до зменшення товщини та в’язкості мукозного шару СОТК, зниження колонізаційної резистентності внаслідок відсутності поживного субстрату для життєдіяльності облігатної флори. Зменшення товщини слизового шару сприяє зниженню як гуморального (IgA), так і клітинного компонентів захисного бар’єра, локалізованого в мукозному гелі, підвищенню проникності кишкового бар’єра для різноманітних токсинів, мікроорганізмів, бактеріальних полісахаридів, які індукують і підтримують імунну запальну відповідь у кишечнику.

Висновки

Таким чином, при функціональних та запальних захворюваннях кишечника порушення захисної функції слизової оболонки має різний патогенез, що може визначати різні підходи до лікування пацієнтів з такими патологіями.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.

Внесок авторів у роботу над статтею. Дорофєєв А.Е. — концепція дослідження, збирання та обробка матеріалу, аналіз результатів, написання тексту, редагування статті; Дядик О.О. — концепція дослідження, збирання та обробка матеріалу, написання тексту; Ткач С.М. — аналіз результатів, написання тексту; Приходько В.М. — збирання та обробка матеріалу.

Отримано/Received 16.03.2022

Рецензовано/Revised 30.03.2022

Прийнято до друку/Accepted 10.04.2022

Список литературы

Colonic immune cells in irritable bowel syndrome: A systematic review and meta-analysis / M. Bashashati et al. Neurogastroenterol Motil. 2018 Jan. № 30(1). doi: 10.1111/nmo.13192. Epub 2017 Aug 29. PMID: 28851005.
Pharmacological, Pharmacokinetic, and Pharmacogenomic Aspects of Functional Gastrointestinal Disorders / M. Camilleri et al. Gastroenterology. 2016. № 150. Р. 1319-1331.
Leech B., Schloss J., Steel A. Treatment Interventions for the Management of Intestinal Permeability: A Cross-Sectional Survey of Complementary and Integrative Medicine Practitioners. J Altern Complement Med. 2019 Jun. № 25(6). Р. 623-636. doi: 10.1089/acm.2018.0374. Epub 2019 Apr 29. PMID: 31038350.
Farré R., Vicario M. Abnormal Barrier Function in Gastrointestinal Disorders. Handb Exp Pharmacol. 2017. № 239. Р. 193-217. doi: 10.1007/164_2016_107. PMID: 27995392.
Zihni С., Mills C., Matter K., Balda M. Tight junctions: from simple barriers to multifunctional molecular gates. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 2016. № 17(9). Р. 564-580.
High-fat Diet Accelerates Intestinal Tumorigenesis Through Disrupting Intestinal Cell Membrane Integrity / M.Y. Park et al. Journal of Cancer Prevention. 2016. № 21(2). P. 95-103.
Simrén M., Tack J. New treatments and therapeutic targets for IBS and other functional bowel disorders. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 2018. № 15(10). Р. 589-605. doi: 10.1038/s41575-018-0034-5. PMID: 29930260.
Enck P., Mazurak N. Dysbiosis in Functional Bowel Disorders. Annals of Nutrition & Metabolism. 2018. № 72(4). Р. 296-306. doi: 10.1159/000488773.
Sheehan G.M., Kallakury B.V., Sheehan C.E. Loss of claudin-1 and -7 and expression of claudin-3 and -4 correlate with prognostic variables in prostatic adenocarcinomas. Human Pathology. 2007. № 38(4). Р. 564-569. doi: 10.1016/j.humpath.2006.11.007.
Tsukita S., Tanaka H., Tamura A. The Claudins: From Tight Junctions to Biological Systems. Trends in Biochemical Sciences. 2019. № 44(2). Р. 141-152. doi: 10.1016/j.tibs.2018.09.008.
Suzuki T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal = Nihon Chikusan Gakkaiho. 2020. № 91(1). Р. e13357. doi: 10.1111/asj.13357.
Citi S. The mechanobiology of tight junctions. Biophysical Reviews. 2019. № 11(5). Р. 783-793. doi: 10.1007/s12551-019-00582-7.
Mast cells are increased in the small intestinal mucosa of patients with irritable bowel syndrome: A systematic review and meta-analysis / A. Robles et al. Neurogastroenterology and Motility: the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 2019. № 31(12). Р. e13718. doi: 10.1111/nmo.13718.
The Relationship between Mucins and Ulcerative Colitis: A Systematic Review / E. Bankole et al. Journal of Clinical Medicine. 2021 Apr 30. № 10(9). 1935. doi: 10.3390/jcm10091935.
Stool and urine trefoil factor 3 levels: associations with symptoms, intestinal permeability, and microbial diversity in irritable bowel syndrome / M. Heitkemper et al. Beneficial Microbes. 2018. № 9(3). Р. 345-355.
Receptor activator of nuclear factor kB ligand, osteoprotegerin, and risk of death following a breast cancer diagnosis: results from the EPIC cohort / D. Sarink et al. BMC Cancer. 2018. № 18(1). P. 1010. doi: 10.1186/s12885-018-4887-3.