Статтю опубліковано на с. 66-70
/66.jpg)
Вступ
При пошкодженні печінкової паренхіми на тлі хронічних дифузних захворювань печінки (ХДЗП) спостерігається поступове розростання або ущільнення сполучної тканини, що представлена екстрацелюлярним матриксом печінки (ЕМП). ЕМП — це біологічно активна пластична спеціалізована субстанція, що здатна швидко змінювати свій склад у відповідь на дію різних фізіологічних чинників [3].
Ряд досліджень доводить роль екстрацелюлярного матриксу в розвитку фіброзу багатьох органів [2]. Провідну роль як у синтезі, так і в деградації компонентів ЕМП відіграють стелатні клітині (СК) печінки. У нормальній печінці СК знаходяться в стані покою, постійно експресуючи певну кількість ЕМП, а також кілька типів металопротеїназ, які беруть участь у його деградації (протеолізі), що забезпечує нормальний кількісний і якісний склад компонентів у перисинусоїдальному просторі [5, 8].
Активація СК супроводжується суттєвим порушенням їх структури і функцій, включаючи втрату накопичення ретиноїдів, трансформацію в міофібробласти, проліферацію, міграцію в зони запалення і некрозу гепатоцитів, а також збільшення продукції цими клітинами компонентів ЕМП [1, 11, 12, 14].
Маркером активації і трансформації СК у міофібробласти є експресія гладком’язового α-актину (що є необхідним для морфогенезу і руху клітин), поява або збільшення на їх поверхні числа рецепторів до фактора росту, інших цитокінів та ендотелію, а також молекул клітинної адгезії [7, 9, 13]. Важливу роль у регуляції функцій СК печінки відіграють цитокіни, більшість з яких стимулює продукцію компонентів ЕМП. У свою чергу, активовані СК продукують ряд хемокінів, що підсилюють міграцію мононуклеарів і нейтрофілів у зони ушкодження печінки [6, 10].
При патології печінки спостерігаються суттєві зміни ЕМП, характер яких залежить від етіології і тривалості дії шкідливого чинника [5, 10]. При гострих ураженнях печінки розвивається типовий процес репаративної регенерації, властивий загоєнню ушкодження епітеліальної тканини, з розвитком спочатку запальної інфільтрації та подальшою активацією СК і трансформацією їх у міофібробласти, формуванням у зонах некрозу і запалення фібрилярного матриксу.
Надалі включаються механізми, спрямовані на деградацію фібрилярного матриксу та відновлення нормального складу ЕМП, а також регенерацію епітелію.
Після припинення дії етіологічного чинника у зонах пошкодження зменшується кількість міофібробластів у результаті їх апоптозу або зворотної трансформації у стелатні клітини [6].
З огляду на це метою нашої роботи було дослідити мікроструктурні зміни гепатоцитів при фіброзуванні печінки, зокрема розподіл маркерів апоптозу та білків цитоскелета.
Матеріали і методи
Обстежений 41 хворий, які проходили лікування у відділенні захворювань печінки та підшлункової залози ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України» з приводу хронічного вірусного гепатиту, асоційованого з вірусом С (ХВГС).
Пункційні біоптати печінки фіксували в 10% формаліні, проводили через ряд спиртів, поміщали в парафін. Гістологічні зрізи товщиною 3–5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином, а також за методом Маллорі в модифікації Слінченка. Для морфометричного аналізу було наведено 2 чи 3 стовпчики тканини, що містять від 4 до 6 портальних трактів. Імуногістохімічне (ІГХ) виявлення PCNA (1 : 200) (ядерний антиген проліферуючих клітин), Вт‑567 (1 : 200) (міозин, білок цитоскелета), цитохрому С (1 : 100) (фермент класу оксидоредуктаз), актину (1 : 100) (білок цитоскелета) проводили на депарафінованих гістологічних зрізах печінки.
Імуногістохімічні дослідження з використанням моноклональних антитіл виконувалися в парафінових зрізах тканини печінки. Після депарафінації зрізів пригнічували активність пероксидази 3% розчином перекису водню на 30 хв. Після блокування пероксидази препарати промивали і переміщали в забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2–7,4) на 5–10 хв. Потім на зрізи наносили розчин специфічних антитіл (Chemicon, Santa Cruz, Abcam, USA) з 1% бичачого сироваткового альбуміну і залишали на ніч, при +4 °C у вологій камері.
На другий день зрізи промивали і наносили вторинні антитіла, мічені біотином (1 : 50). Після завершення інкубації вторинними антитілами залишки реагентів, які не прореагували, змивали буфером. Після промивання на зрізи наносили розчин кон’югату стрептавідину (1 : 150).
Після інкубації зрізи промивали у буфері і виявляли розчином 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлориду (0,01%) (DAB) з перекисом водню (0,06%). Під час реакції пероксидази з DAB у місцях локалізації виявленого антигену утворювався продукт імуногістохімічної реакції темно-коричневого кольору. Препарати дозабарвлювали гематоксиліном та монтували на предметні скельця.
Комп’ютерна морфометрія використовувалась як додатковий метод об’єктивізації морфологічного дослідження. Зрізи, забарвлені за методом Маллорі в модифікації Слінченка, фотографувалися при збільшенні 40 і 100 світлового мікроскопа XSP‑139TP (Ulab, Україна) фотоапаратом Canon PowerShot A630 (Японія). Ділянка паренхіми та фіброзу була виділена і виміряна за допомогою програмного забезпечення ImageJ 1.45S (National Institutes of Health, США). Після виміру проводився розрахунок комп’ютерного індексу фіброзу (КІФ) — відношення фіброзної тканини до загальної площі біоптату. При оцінці результатів ІГХ клітини, що прореагували позитивно, підраховувалися, а результат виражався в кількості клітин/мм2 видимої площі або на велике поле зору.
Для статистичного аналізу отриманого числового матеріалу використовували дескриптивну статистику та кореляційний аналіз за Пірсоном (для даних, що виражені в інтервальній шкалі) та Спірменом (для даних, що виражені в неінтервальних шкалах). Вірогідність відмінностей між групами аналізувалася за допомогою тесту Mann — Whitney U та критерію хі-квадрат. Вірогідним вважалося значення р < 0,05.
Результати дослідження
У першу групу увійшли хворі з ініціальною стадією фіброзу (58,33 % усіх випадків). Групу порівняння (група ІІ) становили хворі з прогресуванням викликаних фіброзом структурних змін печінки (41,67 %).
Із числа хворих І групи перша стадія фіброзу за шкалою METAVIR спостерігалась у 35,71 %, повна відсутність будь-яких фіброзних змін — у 7,14 % (одиничний випадок). Сполучна тканина являла собою перипортальні вузли невеликого розміру навколо незначно розширених портальних трактів, на тлі помірної ЛПІ перипортальної зони (рис. 1А); КІФ становив (0,0370 ± 0,0119) (від 0 до 8,4 %). У 57,14 % пацієнтів спостерігалась друга стадія фіброзу за шкалою METAVIR, що характеризувалась початком формування неповних портопортальних септ. У цьому разі перипортальна ділянка являла собою скупчення щільної сполучної тканини, інфільтрованої лімфоцитами та плазматичними клітинами (рис. 1Б); КІФ становив (0,0620 ± 0,0013) (від 3,2 до 11,8 %).
/68.jpg)
Серед хворих групи ІІ, з прогресуванням викликаних фіброзом структурних змін печінки, у 60,0 % випадків було діагностовано третю стадію фіброзу за шкалою METAVIR з характерним поширенням перигепатоцелюлярного фіброзу, скупченням сполучної тканини навколо портальних трактів і центральної вени, повними та неповними портопортальними і портоцентральними септами (рис. 2А). При цьому портальні тракти були помірно розширені, інфільтровані лімфоцитами і плазматичними клітинами, в окремих випадках спостерігалися некроз і фіброз гепатоцитів пограничної пластинки. КІФ становив (0,1930 ± 0,0318) (7,6–19,3 %).
І, нарешті, у 40,0 % випадків було встановлено цироз печінки або четверту стадію фіброзу за шкалою METAVIR (рис. 2Б). При цьому часточкова будова печінки була помітно порушена, відзначалися повні портопортальні і портоцентральні септи з утворенням мікро- і макронодулярних структур (вузлів). КІФ становив (0,2640 ± 0,0204) (20,4–29,2 %).
При порівнянні структурних змін печінки на ініціальних стадіях фіброзу (група І) і при його подальшому прогресуванні (група ІІ) не було встановлено вірогідних відмінностей в активності гепатиту (р = 0,266), а також характер і поширеність дистрофії гепатоцитів (р = 0,412). Як видно з табл. 1, хоча і спостерігається деяке зростання гістологічної активності гепатиту і поширеності дистрофічних змін печінки, тільки розрахунок КІФ є об’єктивним методом оцінки поширеності фіброзних змін. Так, у І групі КІФ становив (0,051 ± 0,008), а у другій — (0,223 ± 0,029), з підтвердженою статистично вірогідною різницею між групами (р = 0,001).
/69.jpg)
Таким чином, основною мікроскопічною ознакою активації фіброзу в циротично зміненій печінці було збільшення кількості дрібних і тонких фіброзних септ у часточках і псевдочасточках печінки, поява сегментарного перисинусоїдального фіброзу, а також поширення перипортального фіброзу. Для подальшого уточнення процесів, що лежать в основі структурної перебудови печінки при прогресуванні ХВГС, було проведено імуногістохімічне дослідження. У гепатоцитах, жовчних протоках, ендотеліальних клітинах синусоїдів було проаналізовано особливості локалізації цитохрому С, регенераційний потенціал і дифузний розподіл актину та міозину.
У поодиноких гепатоцитах спостерігалась транслокація цитохрому С із цитоплазми в ядро клітин, що демонструвалось інтенсивною реакцією в ядрах, яка свідчить про апоптичний стан клітин (рис. 3А). В ядрах клітин поодиноких гепатоцитів та ядрах клітин жовчних проток спостерігалась експресія PCNA (рис. 3Б).
Цитохром С — це білок із подвійною функцією. Він виступає одноелектронним переносником, вільно пов’язаним із внутрішньою мембраною мітохондрій, та необхідним компонентом дихального ланцюга, але за певних умов може від’єднуватися від мембрани, вільно збиратися у міжмембранному просторі мітохондрій та активувати апоптоз [12]. Його накопичення у великих кількостях при розвитку ХГВС вказує на активацію каспазного механізму апоптозу.
З іншого боку, збільшення кількості PCNA-позитивних клітин вказує на те, що при ХГС активується механізм репаративної регенерації печінки. Кількість клітин у стані регенерації досить широко різниться, тому можна припустити, що в деяких випадках регенераційний потенціал може досить довго забезпечувати відновлення структури печінки, у той час як в інших превалюючі механізми загибелі швидко ведуть до дистрофічних змін.
У більшості випадків (69,23 %) при стандартному морфологічному дослідженні відзначалася білкова дистрофія гепатоцитів різного ступеня вираженості, яка охоплювала від декількох клітин до великих зливних полів. При імуногістохімічному дослідженні експресія міозину спостерігалась в усіх гепатоцитах (рис. 4А), у той час як актин мав вигляд гранулярних включень у цитоплазмі поодиноких гепатоцитів, що перебували саме у стані білкової дистрофії (рис. 4Б).
Система «актин — міозин» є основою мікрофіламентів, що пронизують цитоплазму гепатоцитів і служать опорним скелетом клітини.
У змінених дистрофією гепатоцитах актин набуває вигляду гранулярних включень і визначає прогресування зернистої дистрофії при розвитку ХГВС.
Висновки
1. Розвиток фіброзування печінки у хворих на ХДЗП супроводжується інфільтрацією навколопортальних трактів (р = 0,076), точковими інтрачасточковими та перипортальними некрозами (р = 0,073) і крайовим стоянням лімфоцитів у синусоїдах (0,011). Крім того, хоча не виявлено прямого зв’язку між ступенем гістологічної активності та стадією фіброзу (r = 0,35; p = 0,09), для вираженого фіброзу характерна супутня висока активність гепатиту (р = 0,042).
2. Ядерна локалізація цитохрому С як маркера апоптозу клітин спостерігається в поодиноких гепатоцитах печінкових часточок, що вказує на активацію каспазного механізму апоптозу при прогресуванні розвитку ХВГС.
3. Виявлення поодиноких PCNA-позитивних гепатоцитів у печінкових часточках свідчить про активацію репаративної регенерації печінки при ХВГС.
4. У змінених дистрофією гепатоцитах актин набуває вигляду гранулярних включень в цитоплазмі, що пояснює втрату актином своїх скорочувальних властивостей при ХВГС.
Список литературы
1. Гаврилюк А.О. Клинико-морфологическая характеристика последствий леченого хронического вирусного гепатита В, С и В + С / Гаврилюк А.О., Туманський В.О., Пентюк Н.О. // Вісник проблем біології і медицини. — 2012. — Т. 2, № 3. — С. 183-186.
2. Ивашкин В.Т. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени / В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина, О.Ю. Бондаренко и др. // Оригинальные исследования. — 2002. — Т. 6. — С. 33-38.
3. Assy N.I. Use of proliferating cell nuclear antigen as a marker of liver regeneration after partial hepatectomy in rats / Assy N.I., Gong Y., Zhang M. et al. // J. Lab. Clin. Med. — 1998 Mar. — Vol. 131(3). — Р. 251-6.
4. Delhaye M. Hepatocyte proliferative activity in human liver cirrhosis / M. Delhaye, H. Louis, C. Degraef et al. // J. Hepatol. — 1999 Mar. — Vol. 30(3). — Р. 461-71.
5. Kelman Z. PCNA: structure, functions and interactions / Kelman Z. // Oncogene. — 1997 Feb 13. — Vol. 14(6). — Р. 629-40.
6. Lake-Bakaar G.I. Digital image analysis of the distribution of proliferating cell nuclear antigen in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. / Lake-Bakaar G. I., Mazzoccoli V., Ruffini L. // Dig. Dis. Sci. — 2002 Jul. — Vol. 47(7). — Р. 1644-8.
7. Sarfraz S. Altered expression of cell cycle and apoptotic proteins in chronic hepatitis C virus infection / S. Sarfraz, S. Hamid, A. Siddiqui et al. // BMC Microbiology. — 2008. — Vol. 8. — Р. 133.
8. Theocharis S.E. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in regenerating rat liver after partial hepatectomy / Theocharis S.E., Skopelitou A.S., Margeli A.P. et al. // Dig. Dis. Sci. — 1994 Feb. — Vol. 39(2). — Р. 245-52.
9. Guarino M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition / M. Guarino, A. Tosoni, M. Nebulini // Hum. Pathol. — 2009. — Vol. 40(10). — P. 1365-1376.
10. Henderson N.C. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution / Henderson N.C., Iredale J.P. // Clin. Sci. — 2007. — Vol. 112. — P. 265-80.
11. Nieto M.A. The SNAIL superfamily of zinc-finger transcription factors / M.A. Nieto // Molecular Сell Biology. — 2002. — Vol. 3. — P. 155-166.
12. Nieto M.A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives / M.A. Nieto // Int. J. Dev Biol. — 2008. — Vol. 52. — P. 1-7.
13. Königshoff M. WNT-inducible signaling protein‑1 mediates pulmonary fibrosis in mice and is upregulated in human with idiopathic pulmonary fibrosis / M. Königshoff, M. Kramer, N. Balsara et al. // J. Clin. Invest. — 2009. — Vol. 119(4). — P. 772-787.
/68_2.jpg)
/69_2.jpg)