Международный неврологический журнал 5 (67) 2014

Статья опубликована на с. 19-26

Вступ

Розсіяний склероз (РС) є прогресуючим демієлінізуючим нейродегенеративним захворюванням центральної нервової системи, яке супроводжується утворенням у головному та/або спинному мозку склеротичних бляшок, що призводить до розвитку неврологічних порушень різного ступеня тяжкості [1, 2]. РС зараховують до автоімунних захворювань, оскільки вважають, що саме імунні реакції відіграють ключову роль у процесі демієлінізації аксонів [1, 2]. Як і при інших автоімунних захворюваннях, у хворих на РС виявляють високий титр антитіл (АТ) до антигенів власного організму — автоантитіл (авто-АТ). До них належать авто-АТ зі спорідненістю до окремих білків мієліну, зокрема до основного білка мієліну (ОБМ), глікопротеїну мієліну олігодендроцитів, циклонуклеотидфосфодіестерази та інших білків [8, 11]. Авто-АТ до вказаних антигенів виявлені тільки у хворих на РС, і тому їх визначення у спинномозковій рідині та крові використовують для діагностики цього захворювання та оцінки ступеня його тяжкості [10].

Було встановлено, що в сироватці крові хворих на РC окрім антитіл до ОБМ також присутні антитіла до лінкерного гістону-Н1 [9]. Відомо, що функції гістону-Н1 не обмежуються його участю у структурній реорганізації хроматину ядра еукаріотичних клітин. Гістон-Н1 також присутній на зовнішній поверхні плазматичної мембрани моноцитів, нейронів і астроцитів людини, де він діє як рецептор ліпополісахаридів грамнегативних бактерій [3, 4, 7]. Cинтез позахроматинового гістону-Н1 у нейронах головного мозку відбувається конститутивно, але вміст його у цих клітинах зростає під час пріонних інфекцій та хвороби Альцгеймера [4, 5]. Оскільки було показано, що протеолітична активність щодо ОБМ зумовлена анти-ОБМ-антитілами, ми припустили, що в сироватці крові хворих на РС також можуть бути присутні антитіла, специфічні щодо гістону-Н1. Ймовірно, що присутність антигістон-Н1-автоантитіл у сироватці крові хворих на РС може відображати певні автоімунні процеси, залучені у розвиток цього захворювання.

Мета роботи — вивчення патогенетичного і клінічного значення авто-АТ, специфічних щодо ОБМ та гістону-Н1 при різних варіантах клінічного перебігу та ступенях тяжкості РС.

Матеріали та методи дослідження

У дослідження були включені 55 пацієнтів із вірогідним діагнозом РС згідно з критеріями Мак-Дональда (2010). У табл. 1 наведені демографічні характеристики обстежених хворих на РС.

Середній вік обстеженої нами групи пацієнтів був відносно зрілим і становив 38,16 ± 1,48 року з перевагою жінок (67,27 %), що узгоджується з даними літератури. Переважна більшість хворих (58,18 %, n = 32) була з рецидивуючо-ремітуючим перебігом РС, а найменше — з первинно-прогресуючим (7,27 %, n = 4), у дебюті цього захворювання перебували 9,09 % (n = 5) пацієнтів. Тривалість захворювання виявилась значною і становила 8,29 ± 1,10 року. Найменша кількість пацієнтів захворіли недавно (до 1 року), їх було 10,9 %. Водночас частки хворих із тривалістю патологічного процесу 5–10 років і понад 10 років виявилися майже однаковими (27,27 та 25,45 % відповідно). Переважна кількість обстежених — із середнім ступенем тяжкості (50,91 %). Середній бал за шкалою EDSS знаходився в межах 4,48 ± 0,19. Вагомою виявилась частка хворих із тяжкою інвалідизацією (20 %) (6–9 балів за шкалою EDSS). До групи контролю увійшли 20 практично здорових осіб відповідного віку та статі.

Усім хворим проводили загальноклінічне та неврологічне дослідження. Ступінь вираженості неврологічного дефіциту у хворих на РС визначали за допомогою шкали EDSS та функціональних систем (Functional System, FS). У сироватці крові хворих на РС за допомогою імуноензимного аналізу визначали вміст антитіл, специфічних щодо ОБМ та гістону-Н1. Отримані показники оптичної щільності автоантитіл визначали в умовних одиницях (ум.од.).

Імуноензимний аналіз (ІЕА) здійснювали, як описано в [6]. Для цього на 96-лункові планшети (Nunc, США) сорбували гістон-Н1 людини та ОБМ бика (8 мкг/мл) у 0,1 M карбонатному/бікарбонатному буфері, pH 9,6 при +4 °С упродовж ночі. Планшети тричі промивали ТБС, що містив 0,05% твін-20, і блокували 5% БСА (Sigma, США) у цьому ж буфері впродовж 2 год при +37 °C. У лунки вносили препарати АТ (5 мкг/мл) та інкубували 2 год при +37 °C у ТБС-буфері, що містив 2% БСА та 0,05% твін-20. Після завершення інкубації лунки промивали ТБС, що містив 0,05% твін-20 (3 рази). Наявність АТ детектували після інкубації із антитілами кози, моноспецифічними щодо важких ланцюгів IgG людини, кон’югованих із пероксидазою хрону (Jackson Labor, Німеччина). Імунокон’югати виявляли розчином субстрату, що містив 0,1% ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) у диметилсульфоксиді (Sigma, США), розчиненого у 100 мM Na₂HPO₄ та 50 мM лимонної кислоти, pH 4,5. Розчин ТМВ і субстратний буфер змішували у співвідношенні 1 : 10 і додавали 0,006% розчину пероксиду водню. Реакцію зупиняли внесенням у лунки 25% сірчаної кислоти (1 : 1). Уміст АТ визначали за оптичною щільністю розчину при 450 нм на сканері мікропланшетів BioTek (США).

Результати обробляли за допомогою програм Excel і Statistica 6.0. Розраховували середнє арифметичне і стандартну похибку. Ступінь вірогідності визначали за допомогою t-критерію Стьюдента. За рівень статистичної вірогідності вважали результати при р < 0,05.

Результати і обговорення

П’ятдесят п’ять зразків сироватки крові хворих на РС було тестовано за допомогою методу ІЕА на наявність анти-ОБМ- і антигістон-Н1-антитіл. На рис. 1 наведено дані ІЕА 36 із 55 зразків сироватки щодо спорідненості гістону-Н1 людини та ОБМ бика. За контроль було взято середній уміст цих антитіл у сироватці крові 20 клінічно здорових донорів.

Як видно на рис. 1, у сироватці крові хворих на РС були присутні IgG-антитіла, здатні зв’язуватися з гістоном-Н1, а також із ОБМ. Отримані дані дають підставу припускати, що в сироватці крові хворих на РС окрім анти-ОБМ-IgG-антитіл є і антигістон-Н1-АТ. Відомо, що анти-ОБМ-антитіла мають високу специфічність щодо зв’язування з ОБМ [10, 11]. На основі цих даних можна припустити, що в сироватці крові хворих на РС окрім вузькоспецифічних анти-ОБМ-АТ також можуть бути присутні й АТ, вузькоспецифічні щодо гістону-Н1. Оскільки кінетичні параметри спорідненості антитіл щодо гістону-Н1 на сьогодні не визначені, не виключено, що в сироватці крові хворих на РС окрім високоспецифічних анти-ОБМ-АТ також наявні IgG-автоантитіла із перехресною реактивністю як щодо гістону-Н1, так і до ОБМ. Аналіз амінокислотних послідовностей цих двох білків за допомогою комп’ютерного інтернет-ресурсу BLAST не виявив поліпептидних ділянок, здатних слугувати спільними епітопами для гістону-Н1 і ОБМ. З іншого боку, не можна виключити те, що зв’язування АТ із цими білками зумовлене їхньою третинною структурою, яка може формувати «просторові» епітопи, спільні для цих двох білків. На сьогодні питання поліреактивності антигістон-Н1-АТ залишається нез’ясованим і потребує детального вивчення.

Вивчали показники оптичної щільності анти-ОБМ та антигістон-Н1-АТ, які визначали в умовних одиницях (табл. 2).

Виявили статистично вірогідну різницю між середнім значенням оптичної щільності анти-ОБМ та антигістон-Н1-АТ хворих на РС та контрольною групою (p < 0,01). При цьому спорідненість автоантитіл до гістону-Н1 (середнє значення оптичної щільності) у більшості зразків сироватки крові була значно вищою порівняно зі спорідненістю цих же зразків щодо ОБМ як у контрольній групі, так і в сироватках крові хворих на РС (p < 0,05).

Також визначали залежність показників оптичної щільності анти-ОБМ та антигістон-Н1-АТ у сироватці крові пацієнтів від клінічних характеристик цього захворювання, зокрема від віку, статі, тривалості, перебігу, швидкості прогресування хвороби та ступеня інвалідизації хворих на РС.

У табл. 3 наведено результати середніх значень показників оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ залежно від віку хворих на РС. Усіх обстежених ми розподілили на чотири групи за віком: до 29 років, 30–39 років, 40–49 років та старші за 50 років.

Як видно з табл. 3, було виявлено вірогідну різницю між середніми значеннями рівня оптичної щільності антигістон-Н1- та анти-ОБМ-АТ у сироватці хворих на РС різних вікових груп порівняно з контрольною групою (p < 0,01).

У табл. 4 наведені дані про вплив статевої приналежності пацієнтів із РС на рівень анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ.

Як видно з табл. 4, у групі хворих на РС чоловіків і жінок значення досліджуваних показників виявилися вірогідно вищими порівняно з контрольною групою (p < 0,01). Водночас не було виявлено вірогідно відмінних показників середніх значень оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ між чоловіками і жінками з РС.

У табл. 5 наведено результати рівня анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ у сироватці крові хворих на РС залежно від тривалості патологічного процесу при цьому захворюванні. За тривалістю РС виділили 4 групи пацієнтів: до 1-го року, 1–5 років, 6–10 та понад 10 років.

Як видно з табл. 5, середні значення оптичної щільності антигістон-Н1- та анти-ОБМ-АТ у сироватці крові хворих на РС із різною тривалістю захворювання виявилися вірогідно вищими порівняно з контрольною групою (р < 0,01). Навіть при тривалості хвороби до 1 року показники вірогідно відрізнялися від таких у контрольній групі. Виявлено, що у хворих на РС із тривалістю РС 6–10 років середній показник оптичної щільності антигістон-Н1-АТ найвищий і вірогідно відрізняється від групи пацієнтів із тривалістю захворювання понад 10 років (0,39 ± 0,04 ум.од. проти 0,28 ± 0,04 ум.од., при р < 0,05).

У табл. 6 наведено результати залежності середніх значень показників оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ у сироватці хворих на РС від ступеня інвалідизації за шкалою EDSS. Усіх пацієнтів розподілили на групи залежно від ступеня інвалідизації. З легким ступенем інвалідизації за шкалою EDSS вважали хворих із 0–3,5 бала, із середнім — 4,0–5,5 бала, а з тяжким ступенем — із 6–9 балами.

Значення показників виявилися вірогідно вищими у хворих із різними ступенями інвалідизації порівняно з контрольною групою (р < 0,01). Виявлено, що показник середніх значень рівня оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ залежить від ступеня інвалідизації пацієнтів. Статистично вірогідну різницю між середніми значеннями оптичної щільності антигістон-Н1-АТ отримали у хворих при тяжкому ступені інвалідизації порівняно з пацієнтами з легким ступенем РС (0,4 ± 0,05 ум.од. при тяжкій інвалідизації проти 0,27 ± 0,03 ум.од. при легкій) (р < 0,05).

Вивчали також залежність показників анти-АТ від темпу прогресування хвороби. М’який темп прогресування РС характеризували наявністю легкого рівня інвалідизації (за шкалою EDSS не більше 3 балів) при тривалості хвороби 10 років та більше. Швидкий темп прогресування РС — це перебіг хвороби, при якому протягом 3 років хвороби ступінь інвалідизації за шкалою EDSS наростав до 6 балів або більше.

У табл. 7 наведена характеристика показників оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ залежно від темпу прогресування хвороби.

Як видно з табл. 7, в усіх хворих на РС при різноманітних темпах прогресування хвороби показники автоантитіл вірогідно вищі, ніж у контрольній групі.

У табл. 8 наведено результати середніх значень показників оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ у сироватці крові обстежених нами хворих на РС залежно від типу перебігу хвороби. Виділили 4 типи перебігу РС: рецидивуючо-ремітуючий (РР), первинно-прогресуючий (ПП), вторинно-прогресуючий перебіг (ВП) та дебют (Д).

Як видно з табл. 8, значення оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ у сироватці крові хворих на РС виявилися вірогідно вищими при рецидивуючо-ремітуючому, вторинно-прогресуючому та первинно-прогресуючому типах перебігу хвороби порівняно з контрольною групою (р < 0,01). У випадку дебюту хвороби спостерігали вірогідно вищий рівень оптичної щільності анти-ОБМ-АТ порівняно з практично здоровими особами (0,19 ± 0,07 ум.од. проти 0,04 ± 0,01 ум.од.) (р < 0,05), при цьому показник оптичної щільності антигістон-Н1-АТ вірогідно не відрізнявся від контрольної групи.

Висновки

Таким чином, нами було встановлено, що в сироватці крові хворих на РС присутні антитіла класу IgG із спорідненістю щодо гістону-Н1 та ОБМ (антигістон-Н1- та анти-ОБМ-АТ). Встановлено, що спорідненість автоантитіл до гістону-Н1 є значно вищою порівняно зі спорідненістю цих же зразків щодо ОБМ. Виявлено, що рівень середніх значень показників оптичної щільності анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ визначав клінічні характеристики РС. При тривалості патологічного процесу 6–10 років показник антигістон-Н1-АТ виявився найвищим порівняно з тривалістю понад 10 років. У хворих на РС із тяжкою інвалідизацією (6–9,5 бала за шкалою EDSS) рівнь антигістон-Н1-АТ виявився найвищим порівняно з хворими із легким ступенем тяжкості. Водночас у дебюті цього захворювання показник оптичної щільності антигістон-Н1-АТ вірогідно не відрізнявся від показників норми на відміну від анти-ОБМ-АТ.

Отже, анти-ОБМ- та антигістон-Н1-АТ відіграють важливу роль у патогенезі РС та можуть слугувати діагностичними маркерами тяжкості патологічного процесу при цьому захворюванні.