Журнал «Здоровье ребенка» 6 (33) 2011

Введение

Антиоксиданты в качестве лекарственных средств с оригинальным спектром фармакологического действия с успехом применяются в различных областях медицины [6], однако использование их при гипоксических поражениях мозга новорожденных ограничено и мало изучено, тем более не исследовано действие сверхмалых доз (СМД). Антиоксиданты различных классов (производные оксипиридина, пространственно затрудненные фенолы, альфа-токоферол и др.) используются в терапии ишемических инсультов у взрослых в качестве нейропротекторов [7]. Гибридные антиоксиданты нового поколения, «ихфаны», предлагаются как перспективные терапевтические средства для лечения нейродегенеративных заболеваний [9]. В противоположность природным синтетические антиоксиданты обладают значительно более выраженным и мощным антиокислительным действием, их механизм связан с влиянием на базисные звенья патогенеза цереброваскулярных заболеваний. Кроме того, природные и синтетические антиоксиданты относятся к тому типу агентов, которые обладают способностью оказывать значимые эффекты в сверхмалых концентрациях [8]. Сверхмалыми считаются концентрации вещества 10^-9–10^-18 моль, когда в среде присутствует 1 или несколько молекул вещества, которые, однако, оказывают существенное влияние на характеристики мишени воздействия. В живых объектах мишенями действия антиоксидантов являются клеточные мембраны [10]. Пространственно экранированный фенол фенозан — сильный антиоксидант, влияющий на структуру и функции мембран. Биологически значимыми мишенями воздействия фенозана являются микродомены липосом, фрагменты клеточной мембраны, поверхностные клеточные рецепторы и внутриклеточные органеллы, также система сигнальной трансдукции, репарации и апоптоза клеток [1]. Показана способность фенозана в сверхмалой дозе 10^–14 моль/кг и 10^–4 моль/кг увеличивать содержание белка — регулятора апоптоза р53 и антиапоптозного белка Вcl-2, снижать содержание двунитевых разрывов ДНК в клетках, что указывает на стимуляцию процессов репарации и преобладание их над апоптозом при действии фенозана. Вероятно, фенозан-кислота (ФК) в СМД вызывает стимуляцию различных сигнальных путей, приводящих к активации белка p53 [16]. Преимущества альфа-токоферола (a-ТФ) перед другими антиоксидантами состоят в том, что он обладает наибольшей мощностью антиоксидантного действия, которая обусловлена, во-первых, его исключительно высокой антирадикальной активностью за счет способности вступать в непосредственное взаимодействие со свободными радикалами и, во-вторых, способностью стабилизировать липидный бислой мембран путем образования прочных комплексов с полиненасыщенными жирными кислотами мембранных липидов [15]. Благодаря своей липофильности, локализуясь во всех биологических мембранах, a-ТФ оказывает влияние как на антиокислительную активность липидов, так и на их структурное состояние, являющиеся центральными звеньями в цикле перекисного окисления липидов (ПОЛ) [11, 13].

Установлено, что a-ТФ и ФК проявляют антиокислительные свойства в широком интервале концентраций на моделях спонтанного и инициированного ПОЛ (10^-4–10^-20М), стабилизируя структуру различных биологических мембран (в том числе и в низких концентрациях) [5]. Зависимости «доза — эффект» для образования различных продуктов окисления и расходования ненасыщенного липидного субстрата имеют нелинейный би- или полимодальный характер, что характерно для веществ, проявляющих эффект в СМД [4]. Альфа-токоферол наиболее эффективен в концентрациях 10^-19, 10^-16, 10^-8, 10^-3 моль/л, тогда как наиболее эффективной СМД для фенозана является концентрация 10^-16 моль. Максимумы на кривых по изменению структурных характеристик липидов под действием a-ТФ и ФК совпадают с максимумами их биологической активности in vivo [2]. Сверхнизкие концентрации a-ТФ и ФК, изменяющие микровязкость глубоколежащих и параметр упорядоченности поверхностных слоев липидов, индуцируют появление дополнительного структурного перехода в интервале физиологических температур (34–40 ^оС), что может приводить к изменениям в работе мембраносвязанных ферментов [8]. Механизмы этих явлений активно исследуются, однако до конца не раскрыты. Учитывая непременное вовлечение повреждения мембранных структур мозга в механизмы клеточной гибели при гипоксии (апоптоз, некроз, некроапоптоз [14]), раскрывающиеся перспективы использования антиоксидантов в СМД для коррекции последствий гипоксического поражения кажутся заманчивыми. В свете вышеизложенного представляет интерес изучение влияния сверхмалых доз антиоксиданта на уровень генерации активных форм кислорода и активность ферментов антиоксидантной защиты в мозге и крови после перенесенной внутриутробной гипоксии плода, что и явилось целью работы. Учитывая нежелательность грубого вмешательства в организм новорожденного и патогенетическую обоснованность применения антиоксидантов, нами исследовано влияние сверхмалых доз водо- и жирорастворимого антиоксидантов у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

Материалы и методы

Нами оценены уровень генерации активных форм кислорода (АФК) и активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты в гомогенате мозга, периферической крови в течение неонатального периода у крысят, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию. Исследование проведено на белых беспородных крысах, в эксперименте участвовало 75 беременных самок и 365 крысят в возрасте 0–21 сутки жизни. Крысам-самкам в хроническом эксперименте воспроизводилась общая гипобарическая гипоксия. Животных десятикратно погружали в специальную камеру, где в течение 1 часа создавалось давление 41,1 кПА, что соответствует подъему на высоту 7000 м. После родов произведено обследование новорожденных крысят: при рождении, на 1, 3, 5, 8, 10, 12, 21-й дни жизни. Забой животных проводили путем декапитации под эфирным наркозом. Из мозга готовили гомогенаты. Среда выделения состояла из 0,125М KCl. Количество малонового диальдегида (МДА) определяли по методу И.Д. Стальной и соавт., активность каталазы — по С.М. Зубковой и соавт., активность супер­оксиддисмутазы (СОД) — по методу P.H. Mirsa, E.S. Fridovich в модификации О.С. Брусова с соавт. Синтетический антиоксидант фенозан, синтезированный в Институте химической физики АН России, вводили в СМД (10^-14 моль/кг) трехкратно новорожденным крысятам первой группы сравнения в 1, 2-е, 3-и сутки жизни per os. Альфа-токоферол в виде альфа-токоферола ацетата вводили в дозе 10^-16 моль/кг аналогично на 1, 2-е, 3-и сутки жизни крысятам второй группы сравнения. Опытную группу составили крысята, рожденные от самок, подвергнутых гипоксии, и не получавшие коррекции в неонатальном периоде. В контрольную группу вошли животные, идентичные по возрасту, родившиеся от здоровых самок и содержавшиеся в условиях вивария.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что в гомогенате мозга уровень МДА при рождении в опытной группе превышает контроль в 1,4 раза, прогрессивно увеличиваясь к концу первых суток, а затем постепенно снижается к 21-му дню наблюдения, достоверно не отличаясь от контроля. Отметим, что после рождения по мере развития мозга у крыс происходит увеличение содержания в нем уровня МДА, который к 21-му дню не отличается от аналогичного показателя у взрослых крыс. Перенесенная хроническая внутриутробная гипоксия способствует накоплению МДА в ткани мозга уже к моменту рождения, а спонтанное понижение концентрации МДА отмечается лишь к 21-му дню жизни — то есть сроку, соответствующему переходу крыс на дефинитивное питание. При введении нанодоз водорастворимого антиоксиданта фенозана снижение уровня МДА до контрольного уровня наблюдается раньше — к 10-м суткам, при введении жирорастворимого альфа-токоферол — на 12-е сутки. Это указывает на то, что введение антиоксидантов предотвращает накопление в мозге токсичного МДА, обеспечивая условия для нормального развития мозга.

Изменения активности ферментов антиоксидантной защиты СОД и каталазы в мозге у крысят, подвергнутых внутриутробной гипоксии, имеют однонаправленный характер, отражая напряжение компенсаторных способностей антиоксидантной системы, а затем их истощение и постепенное восстановление, которому способствует введение нанодоз фенозана. Активность СОД в ткани мозга у крысят опытной группы при рождении повышена в 1,8 раза относительно контроля, к концу первых суток она резко понижается до уровня в 1,9 раза ниже контроля. В течение 3–8 суток активность СОД постепенно восстанавливается и начиная с 10-х суток достоверно не отличается от контроля. При введении нанодоз фенозана активность СОД восстанавливается значительно быстрее, становясь сравнимой с контролем начиная с 5-х суток жизни, тогда как при введении альфа-токоферола — лишь на 21-е сутки жизни, что доказывает высокую эффективность действия фенозана в мозговой ткани (табл. 1).

Анализ активности каталазы показал, что в гомогенате мозга непосредственно после рождения она несколько повышена (в 1,2 раза), а затем резко понижается, достигая значений в 1,6 раза ниже контроля на 3-и сутки жизни. К 5-му дню отмечается рост каталазной активности, имеющий невыраженный характер, так как на 21-й день эксперимента активность каталазы оставалась сниженной в 1,5 раза относительно контроля. При введении фенозана имело место восстановление активности каталазы в гомогенате мозга начиная с 8-х суток жизни, при использовании альфа-токоферола — лишь на 21-е сутки. Несмотря на то что уровень активности каталазы у крыс, получавших антиоксиданты, при этом ниже контроля, у крыс, получавших фенозан, он достоверно отличается от показателей в опытной группе во все сроки наблюдения; при введении альфа-токоферола эти отличия достоверны лишь начиная с 8-х суток жизни.

В периферической крови пик увеличения концентрации МДА приходится на 3-и сутки неонатального периода, что свидетельствует об активном вымывании МДА из мозга в кровь. Спонтанная нормализация концентрации МДА в крови происходит на 21-й день. При введении фенозана понижение концентрации МДА в крови отмечается уже с 3-х суток жизни, а эффект фенозана в крови более выражен, чем в мозге. Как видно из табл. 2, показатели МДА в периферической крови достоверно отличаются в опытной группе и группе, получавшей фенозан, во все сроки наблюдения, за исключением 1-х и 21-х суток эксперимента. Это обусловлено отсутствием мгновенного действия фенозана непосредственно после введения на 1-е сутки и самостоятельным восстановлением уровня МДА за счет компенсаторно-приспособительных сил организма к 21-му дню. Отметим, что у крыс опытной группы и в группе, получавшей фенозан, уровень МДА отличается в 2,4; 3,9; 2,8; 3,0 и 1,9 раза на 3-и, 5, 8, 10, 12-е сутки соответственно. Введение альфа-токоферола оказывает еще больший положительный эффект, поскольку уже на 5-е сутки жизни концентрация МДА в крови у крыс этой группы достоверно не отличается от контроля, тогда как при введении фенозана достоверное отличие от контроля появляется лишь на 21-е сутки. Активность СОД в крови у крыс опытной группы резко понижена уже при рождении — в 5,14 раза относительно контроля, и продолжает снижаться к концу 1-х суток, становясь в 7,9 раза ниже, чем в контрольной группе. Начиная с 3-х суток эксперимента активность СОД несколько возрастает, однако не достигает уровня контроля даже на 21-й день жизни, оставаясь сниженной в 1,4 раза по отношению к нему. Спонтанной нормализации активности СОД в крови не происходит во все сроки наблюдения, а введение фенозана и альфа-токоферола способствует повышению активности фермента. Динамика каталазной активности в крови после хронической гипоксии — реоксигенации отражает реакцию целостного организма и свидетельствует о мобилизации компенсаторно-приспособительных механизмов к моменту рождения с последующим их истощением к 3-му дню жизни. Начиная с 5-х суток наблюдается повышение активности каталазы крови, которое, однако, не достигает уровня контроля. Введение фенозана способствует нормализации активности каталазы крови к 21-му дню жизни и достоверному ее увеличению относительно опытной группы в остальные сроки наблюдения.

Введение альфа-токоферола приводит к восстановлению каталазной активности до контрольного уровня уже на 12-е сутки жизни, что указывает на высокую эффективность жирорастворимого антиоксиданта в активации ферментов антиокислительной активности в крови.

Как показали результаты наших исследований, наиболее уязвимыми в отношении усиления генерации активных форм кислорода являются крысы на 3–8-й дни жизни. Если к 10-му дню уровень генерации АФК в ткани мозга снижается, то к 21-му дню происходит полная нормализация концентрации МДА. Это согласуется с утверждением о том, что у крыс на 4–7-й день жизни чувствительность к эк­сайт­отоксическим аминокислотам минимальна и увеличивается к 8–12-му дню, а к 18-му дню от NMDA-эксайтотоксичности погибает до 90 % нейронов [17]. В мозге предиктором выхода кальция и запуска NMDA-токсического каскада, а также предиктором нарушения мембранного потенциала с развитием нарушения поглощения кислорода клеткой и ее гибелью является активация генерации АФК в митохондриях незрелых нейронов. Нейроны способны остановить нарушенный кальциевый гомеостаз: если он непродолжителен — в течение нескольких дней, если нарушение длится более недели — то это невозможно и клетки погибают. Мы полагаем, что введение нанодоз антиоксидантов фенозана и альфа-токоферола позволяет купировать активацию генерации АФК в эти критические периоды и обеспечить нормальное развитие клеток мозговой ткани.

Полученные нами результаты согласуются с ранее выявленными фундаментальными представлениями о механизмах действия фенозана и зависимости их от дозы. Фенозан обладает стабилизирующим эффектом на поверхностные слои и глубоко лежащие области липидов плазматической мембраны и мембран эндоплазматической сети в широком диапазоне концентраций 10^-3–10^-23 М, является супер­активатором протеинкиназы С [1, 2]. Существуют данные, что эффекты фенозана обусловлены его прямым влиянием на ферменты, реакцией с пероксирадикалами, реакцией с активными формами кислорода, рецепторными взаимодействиями, параметрическим резонансом, структурной памятью воды, что особенно ярко проявляется при действии мнимых концентраций фенозана. Возможно, обнаруженное нами понижение концентрации конечного продукта липопероксидации МДА под действием фенозана обусловлено снижением его образования за счет обрыва цепи в результате реакции самонейтрализации (рекомбинации) свободных радикалов, что, в свою очередь, может быть обусловлено свойствами особых структур воды, упорядоченной фенозаном [3, 12].

Выводы

1. Ткань мозга крыс, перенесших внутриутробную гипоксию, в неонатальном периоде характеризуется высокими компенсаторными способностями, что делает возможной спонтанную нормализацию окислительного стресса и восстановление активности ферментов антиокислительной системы к 21-м суткам жизни.

2. Введение фенозана и альфа-токоферола в СМД приводит к снижению уровня МДА и восстановлению активности СОД и каталазы в мозге, наиболее заметным при использовании водорастворимого антиоксиданта, что является предпосылкой для нормализации патологического процесса в более ранние сроки.

3. В периферической крови после перенесенной внутриутробной гипоксии наблюдается выраженное угнетение активности СОД и каталазы на фоне всплеска уровня МДА, не нормализующиеся спонтанно к 21-му дню жизни, что свидетельствует о поддержании патологического процесса в отдаленные сроки после реоксигенации.

4. Динамика активности СОД и каталазы в крови после хронической гипоксии — реоксигенации, отражая реакцию целостного организма, свидетельствует о мобилизации компенсаторно-приспособительных механизмов к моменту рождения с последующим их истощением к 3-му дню жизни, восстановление которых наиболее интенсивно происходит при введении альфа-токоферола.

5. Установлена высокая эффективность СМД фенозана в первые 24–72 часа реоксигенации как в ткани мозга, так и в крови; альфа-токоферол в СМД не оказывал заметного влияния в ткани мозга, проявляя высокую эффективность в крови.